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獸藥工程中心院士工作站專家團(tuán)隊科研成果展示研發(fā)動態(tài)

獸藥殘留檢驗方法

時間：2014-09-19 來源：迅達(dá)康

　　近年來,隨著獸藥的種類和應(yīng)用規(guī)模劇增，特別是抗生素在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用增加,由此導(dǎo)致的動物性食品中獸藥殘留問題日益突出人們對獸藥殘留問題也日益關(guān)注。獸藥殘留分析是復(fù)雜混合物中痕量組分的分析技術(shù)。殘留分析既需要精細(xì)的微量操作手段,又需要高靈敏的痕量檢測技術(shù),難度大、儀器化程度和分析成本高,分析質(zhì)量控制和分析策略(如篩選性分析、確證性分析)有特殊要求�，F(xiàn)對獸藥殘留分析中分離和檢測技術(shù)現(xiàn)狀及發(fā)展動向做一簡要介紹。

　1　樣本前處理

　1. 1　提取

　提取是使用適當(dāng)溶劑將待測物連同部分樣本基質(zhì)從固態(tài)樣本轉(zhuǎn)至易于凈化或分析的液態(tài),通�？沙�99%的樣本雜質(zhì)。根據(jù)樣本的性質(zhì)選擇溶劑,如脂肪或水分含量。使用水溶性有機(jī)溶劑(乙腈、甲醇、丙酮等)有許多優(yōu)點(diǎn):溶劑和動物樣本易混合,提取速度快;溶劑溶解作用強(qiáng);提取液pH值可以調(diào)節(jié),適用范圍廣;提取的同時兼脫蛋白和脫脂;待測物在樣本提取液中均勻分布,可只移取部分上清液或濾液進(jìn)行分析,無需

　反復(fù)提取將待測物全部轉(zhuǎn)出。

　1. 2　凈化

　凈化即將待測物與提取液中的樣本干擾雜質(zhì)分離。前處理中凈化的工作量最大,但一個具有強(qiáng)大分離效能或高選擇性檢測能力的測定體系可大大降低對凈化的要求。獸藥殘留分析中常用的凈化方法是液- 液分配和固相萃取。

　1. 2. 1　液- 液分配

　液- 液分配屬經(jīng)典的凈化手段。等體積的分配體系中溶質(zhì)分配平衡后溶解在非極性或極性較弱的溶劑中溶質(zhì)的百分比稱為p值,利用p值可以選擇萃取系統(tǒng)、計算萃取次數(shù)和抽出率。通過調(diào)節(jié)溶液的pH值、極性、離子對形成等手段選擇性地改變待測物的p值是常用的凈化方法,如組織中磺胺類藥物的凈化[ 1 ]。多數(shù)獸藥屬有機(jī)酸或有機(jī)堿類化合物,離子對萃取法在獸藥殘留分析中有重要價值。

　1. 2. 2　固相萃取

　固相萃取作為凈化手段,其基本原理與開放式柱色譜相同。固相萃取中樣本與微細(xì)顆粒填料(Φ70～150μm)接觸面積大,凈化速度快,分離效能高;操作簡便,溶劑用量少,回收率高。所以近年來固相萃取發(fā)展很快。吸附層析常用的填料如硅膠、氧化鋁,因其吸附性能受自身和樣品的含水量影響很大,需嚴(yán)格控制。大孔樹脂(聚苯乙烯)為一種反相吸附劑,可直接凈化含水試樣。分配層析中常用的反相填料為鍵合有十八烷基(C18)或辛烷基(C8)的硅膠,是目前應(yīng)用最普遍的固相萃取技術(shù)。

　基質(zhì)固相分散(matrixsolid - phasedispersion, MSPD ) 是1989年由美國Louisiana州立大學(xué)的S A Barker教授首次提出并給予理論解釋的一種嶄新的固相萃取技術(shù)。其基本操作是將樣本直接與適量反相填料(C18或C8)研磨、混勻,制成半固態(tài)裝柱、淋洗。作為樣本凈化技術(shù),它具有直接處理樣本的優(yōu)點(diǎn),快速的分離過程和較高的分離效能,特別適宜于多殘留組分快速分離和分析自動化。MSPD的簡單操作中濃縮了傳統(tǒng)的樣本前處理中所需的樣本勻化、組織細(xì)胞裂解、提取、凈化等過程,但避免了樣本勻化、轉(zhuǎn)溶、乳化、濃縮和靜電造成的待測物損失;凈化后的樣品可直接進(jìn)行測定,測定速度快(十幾分鐘) ,所用有機(jī)溶劑量減少(幾十毫升) 。

　1. 2. 3　薄層色譜( TLC)

　TLC作為樣本凈化手段具有直觀、速度快、樣本容量大和分離效能高(顆粒Φ30～50 μm)等優(yōu)點(diǎn)。但對紫外- 可見區(qū)無吸收的待測物卻難以定位,有些待測物可通過標(biāo)準(zhǔn)品顯色來解決。

　1. 3　濃縮

　濃縮是待測物富集或轉(zhuǎn)溶的常用方法。前處理中以濃縮過程待測物損失最大。應(yīng)避免樣品液被直接蒸干,否則待測物可能附著于器皿上或與樣本基質(zhì)結(jié)合使回收率下降,高極性待測物如磺胺類藥物較為嚴(yán)重。

　1. 4　衍生化

　衍生化提高檢測的靈敏度和選擇性已成為殘留分析中衍生化的最主要目的,如給待測物連接強(qiáng)電負(fù)性基團(tuán)以適于氣相色譜的電子捕獲檢測器檢測、HPLC的紫外或熒光衍生化等。

　HPLC衍生化分為柱前和柱后衍生化。柱后衍生化需要專門的反應(yīng)裝置(高壓泵、混合及反應(yīng)管道) ,待測物從色譜柱流出后與衍生化試劑反應(yīng),再進(jìn)入檢測器。其突出優(yōu)點(diǎn)是在線反應(yīng),動態(tài)檢測,無需反應(yīng)進(jìn)行完全,不影響現(xiàn)有的分離條件;主要不足是衍生化試劑可能對檢測有干擾,對流動相亦有限制。

　2　測定方法

　2. 1　氣相色譜法

　氣相色譜法有許多高靈敏、通用性或?qū)Ｒ恍詮?qiáng)的檢測器供選用,如氫焰離子化檢測器( FID) 、氮磷檢測器(NPD)等,檢測限一般為μg/kg級。但是大多數(shù)獸藥極性或沸點(diǎn)偏高,需繁瑣的衍生化步驟,限制了GC的應(yīng)用。所以, 20 世紀(jì)80 年代后HPLC的發(fā)展速度超過GC,相當(dāng)數(shù)量的獸藥采用或改用HPLC進(jìn)行分析,如氯霉素、磺胺類藥物等。

　2. 2　高效液相色譜法

　幾乎所有的化合物包括高極性/離子型待測物和大分子物質(zhì)均可用HPLC進(jìn)行測定。HPLC的分離機(jī)制與常規(guī)柱色譜相同,但填料更加精細(xì)(Φ5～10μm) ,可重復(fù)進(jìn)樣,分析速度快。HPLC至今仍缺乏可滿足獸藥殘留分析要求的通用型檢測器。紫外檢測器(UVD)最普及,其次是熒光檢測器和電化學(xué)檢測器。光二極管陣列檢測器是近十年來HPLC最重要的突破。DAD可同時接收整個光譜區(qū)的信息,在色譜峰流出同時能進(jìn)行每個瞬間的動態(tài)光譜掃描并快速采集信號,經(jīng)計算機(jī)處理后得到色譜- 光譜的三維圖譜,信息量大大增加。一次進(jìn)樣可得到每個組分峰的定量、定性和純度信息, 靈敏度亦明顯提高。大部分抗生素在高于230 nm的光譜區(qū)無吸收,而在低于230 nm的紫外區(qū)許多樣本基質(zhì)和流動相產(chǎn)生干擾,需衍生化后測定,限制了紫外檢測器的應(yīng)用。旋光檢測有以下特點(diǎn):(1)選擇性高,樣本僅需簡單提取即可;(2)靈敏度高,利用He- Ne激光作光源,靈敏度可達(dá)5～10μg水平;(3)可同時得到流出組分的比旋度,用以定性。目前,該方法已用于紅霉素、慶大霉素、羧芐青霉素和吩羧青霉素殘留的測定。

2. 3　高效薄層色譜(HPTLC)

　HPTLC的出現(xiàn)使TLC進(jìn)入了復(fù)興時期,現(xiàn)已成為僅次于HPLC和GC的殘留分析方法。HPTLC的斑點(diǎn)原位掃描定量、定性和高效分離材料(Φ3～10μm) 。改變了常規(guī)TLC在靈敏度和重現(xiàn)性方面的不足,但保持了TLC的簡便、快速和樣品容量大的優(yōu)點(diǎn),可使用正相或反相板,分辨率幾乎與HPLC相當(dāng)。HPTLC在獸藥殘留的快速篩選性檢測方面應(yīng)用廣泛。

　2. 4　超臨界流體色譜( SFC)

　SFC可彌補(bǔ)GC和HPLC的不足,但不可能取代二者。SFC最大優(yōu)點(diǎn)是可以方便地連接各種靈敏的檢測器(MS, ECD等) ,如豬組織中磺胺類藥物等抗菌素殘留的SFC -MS分析。

　2. 5　毛細(xì)管區(qū)域電泳(CZE)

　CZE是20世紀(jì)90 年代以來研究最活躍的分析技術(shù)之一。1989年開始有商品出售。CZE不同于傳統(tǒng)的凝膠電泳技術(shù), CZE使用直徑僅25～50μm的毛細(xì)管而不用載體,待測組分在高壓(20～30 kV)下泳動,截面積小,熱量和泳速均勻。所以, CZE兼有高壓電泳的高速、高分辨和HPLC靈活、高效的優(yōu)點(diǎn),柱效高達(dá)106塔板/m。向電解質(zhì)中加入超臨界膠束濃度的表面活性劑,如十二烷基硫酸鈉( SDS) ,即為毛細(xì)管膠束電動色譜( cap illarymi - cellarelectrokineticchromatography,CMEC) ,分離范圍可擴(kuò)展至中性或兩性分子,分離效能亦進(jìn)一步提高。CZE將在簡化樣本前處理、多殘留分析和分析自動化方面發(fā)揮重要作用。目前CZE的主要問題是樣品量太小,限制了檢測的靈敏度。CZE - MS可能是最好的解決辦法。

　2. 6　聯(lián)用技術(shù)

　各種分析技術(shù)聯(lián)用是現(xiàn)代獸藥殘留分析乃至整個分析化學(xué)方法上的發(fā)展特點(diǎn)。計算機(jī)的應(yīng)用加速了這一趨勢。聯(lián)用技術(shù)可揚(yáng)長避短,一般兼分離、定量和定性(分子結(jié)構(gòu)信息)于一體,因而特別適用于確證性分析。常見的聯(lián)用技術(shù),如TLC- MS、GC - MS、LC - MS、CZE - MS、LC - NMR、SFC - MS等。

　TLC - MS是最簡單的離線聯(lián)用技術(shù)。GC - MS已相當(dāng)成熟,應(yīng)用相對較多。但這些聯(lián)用儀價格昂貴,遠(yuǎn)不如HPLC或GC那樣普及。MS無疑可作為HPLC的通用型檢測器。使用微型柱(15 ×0. 3 cmid)和適宜的接口技術(shù),如熱噴霧( TSP) 、微粒束( PB)等解決了LC與MS的連接問題;使用軟電離技術(shù),如快原子轟擊( FAB) 、場解吸( FD)等解決了難氣化物質(zhì)的離子化問題。LC - MS現(xiàn)在已進(jìn)入實用階段,其靈敏度較熒光檢測器高1個數(shù)量級,能方便地對ng級的獸藥殘留組分進(jìn)行檢測與結(jié)構(gòu)確證。

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